Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
Mục lục
Mở đầu 1
Chơng 1. Tổng quan tài liệu 2
1.1 Các hợp chất thực vật thứ sinh 2
1.3.1 Các hợp chất phenol (hợp chất phenolic) [2, 19, 20, 22] 3
1.1.2 Flavonoid [2, 19, 22] 5
Tannin [2, 56, ] 8
1.2 Proteinase và các chất ức chế proteinase 10
1.2.1 Sơ lợc về Proteinase 10
1.2.2 Serine Proteinase 12
1.2.2.1 Serine Proteinase 12
1.2.2.2 Protease của Pseudomonas 13
1.4.2.2 Các chất ức chế proteinase 14
1.3 Tơng tác của flavonoid với các protein enzyme [22] 16
1.5.1 Các lực tơng tác phân tử trong phức chất protein-flavonoid [12] 17
1.5.2 Tính đặc hiệu của tơng tác protein-flavonoid 18
1.5.3 ảnh hởng của các flavonoid với sự thuỷ phân protein 19
1.4 Cây thuốc việt nam và khả năng chữa các bệnh mụn nhọt,
mẩn ngứa 20
1.4.1 Sơ lợc về các bệnh mụn nhọt, mẩn ngứa 20
1.4.1 Cây gỗ vang (T\ô mộc) 21
1.4.1.1 Đặc điểm phân loại, phân bố, thành phần hóa học và c\ông dụng 21
1.4.2.2 Các nghiên cứu trên thế giới 22
1.4.2.3 Các nghiên cứu tại Việt Nam 23
1.2.3 Các nghiên cứu tại Việt Nam 23
Chơng 2. NGUYÊN LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 25
2.1 Nguyên liệu 25
2.3 Phơng pháp nghiên cứu 25
2.3.2 Tách chiết flavonoid toàn phần 26
2.3.3 Định lợng polyphenol theo phơng pháp Folin-Ciocalteau 26
Sắc ký phân chia các thành phần polyphenol 27
2.3.5 Xác hoạt độ ức chế proteinase 29
2.3.6 Điện di protein trên gel Polyacryamide 32
2.3.7 Sắc ký cột silicagel 33
2.3.7 Sắc ký cột silicagel 34
Chơng 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 34
5
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
3.1 Hàm lợng polyphenol tổng số và hoạt tính ức chế proteinase
ở một số cây thuốc 34
3.1.1 Điều tra sơ bộ PIA các mẫu nghiên cứu 34
3.1.2 Hàm lợng polyphenol tổng số và flavonoid trong dịch chiết ethanol 38
3.1.3 Hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết polyphenol tổng số và flavonoid. 40
3.3 Định tính các thành phần polyphenol và flavonoid trong
một số cây thuốc 43
3.2.1 Sắc ký dịch chiết flavonoid các mẫu nghiên cứu 43
3.2.2 Sắc ký các thành phần polyphenol mẫu T\ô mộc trên bản mỏng 44
3.4 Thăm dò PIA của các băng polyphenol sau khi sắc ký bản
mỏng 45
3.3.2 PIA các băng flavonoid mẫu T\ô mộc 46
3.4 Hàm lợng tannin của các mẫu T\ô mộc 50
3.5 Thăm dò hoạt độ PIA b\ằng phơng pháp điện di PA trên gel
polyacryamide 50
3.5.1 Hoạt độ phân giải proteinase của P. aeruginosa và S. aureus 50
3.5.1 Nghiên cứu PIA b\ằng phơng pháp điện di 52
3.5.2 Nghiên cứu PIA b\ằng phơng pháp điện di 52
3.6 Hoạt tính kháng khuẩn các mẫu T\ô mộc 53
3.7 Phân chia các thành phần flavonoid trên cột silicagel 54
Kết luận 58
Tài Liệu Tham Khảo 61
6
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
Mở đầu
Các enzyme thủy phân protein có vai trò vô cùng quan trọng trong toàn
bộ sinh giới, hiện nay số chuỗi polypeptide có hoạt tính thuỷ phân protein đã
biết lên hơn 140.000 [50]. Tuy nhiên các enzyme này cũng có liên quan đến rất
nhiều bệnh ở ngời nh các bệnh viêm nhiễm, ung th, tim mạch Theo thống
kê, có tới 80 bệnh di truyền khác nhau ở ngời có nguyên nhân là do đột biến các
gene mã hóa các protease [72], sự di căn của ung th cũng có sự tham gia của
các protease [51]. Các enzyme thuỷ phân cũng tham gia tích cực trong quá trình
viêm và sự hình thành mụn nhọt ở ngời.
Khả năng phân giải protein của các proteinase rất lớn nên cần có những
cơ chế điều hòa chặt chẽ, trải qua quá trình tiến hóa lâu dài đã xuất hiện nhiều
cơ chế kiểm soát proteinase bao gồm điều hòa biểu hiện, quá trình tiết ra
ngoài tế bào, hoạt hóa, phân hủy proteinase hoặc kìm hãm hoạt độ thủy phân
protein của chúng. Nói đến các chất kìm hãm proteinase, các nhà khoa học th-
ờng đề cập đến các PPI là các chất ức chế proteinase có bản chất protein, có các
cấu trúc đặc trng. Các PPI có mặt rộng rãi trong sinh giới từ virus, vi khuẩn cho
tới động vật [49]. Thực vật tạo ra PPI khi bị côn trùng tấn công, khi bị tổn thơng
hay dới các điều kiện stress [19, 49]. Tuy nhiên thực vật còn có một cơ chế
khác chống lại các tác nhân gây hại trên là hệ thống các chất trao đổi thứ sinh,
trong đó có các hợp chất phenol. Các phenol này không những có hoạt tính
kháng sinh mạnh mà còn có khả năng ức chế nhiều loại enzyme.
Các chất thực vật thứ sinh có hoạt tính sinh học là thành phần chính có
mặt trong các vị thuốc cổ truyền. Nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa các hợp chất
phenol từ thực vật và khả năng ức chế proteinase của một số cây thuốc chữa
mụn nhọt, mẩn ngứa, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Polyphenol và
hoạt độ ức chế serine-proteinase từ thân, hạt cây gỗ Vang (Caesalpinia
sappan L.) và một số cây thuốc khác.
1
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
Chơng 1
Tổng quan tài liệu
1.1 Các hợp chất thực vật thứ sinh
Các con đờng biến đổi và tổng hợp các chất dinh dỡng chủ yếu:
carbohydrate, protein, chất béo và acid nucleic là thiết yếu và giống nhau ở mọi
sinh vật ngoại trừ một số thay đổi rất nhỏ. Quá trình thống nhất, và là nền tảng
của mọi sinh vật sống này đợc gọi là các quá trình trao đổi sơ cấp. Trên thực tế
thực vật còn tổng hợp một lợng lớn các hợp chất hữu cơ không có vai trò trực
tiếp trong sinh trởng và phát triển của chúng, các hợp chất này đợc gọi là hợp
chất thứ sinh.
Các hợp chất thứ sinh đợc phát hiện riêng lẻ ở từng nhóm, từng loài nhất
định, thậm chí khác nhau ở từng cá thể, hàm lợng cũng thay đổi từng loài, từng
cơ quan, bộ phận và điều kiện sinh thái của cây. Chức năng và lợi ích của các
hợp chất này đối với thực vật phần lớn đã đợc chỉ ra nh: tham gia bảo vệ cây,
điều hòa sinh trởng, hấp dẫn côn trùng, thụ phấn, phát tán hạt tuy nhiên cũng
còn có nhiều chức năng khác cha đợc biết đến [60].
Quá trình trao đổi thứ cấp này cung cấp phần lớn sản phẩm có giá trị
trong y dợc bởi vì các hợp chất thứ sinh thờng có hoạt tính sinh học nh: kích
thích hoặc ức chế sinh trởng, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kìm hãm sự phát
triển của các khối u
Trớc đây các hợp chất thứ sinh đã từng bị xem là những chất thải đơn
giản trong trao đổi chất ở thực vật, ngày nay với những nghiên cứu mới ngời ta
đã xác định đợc khoảng 140.000 các hợp chất này, tìm ra con đờng trao đổi chất
có liên quan cũng nh các enzyme sản xuất và điều hòa các con đờng này. Tuy
nhiên cho đến nay chỉ khoảng 20 - 30% tổng số các loài thực vật đợc đợc
nghiên cứu về các hợp chất hóa sinh thực vật, do đó thực tế có thể có tới hơn
200.000 hợp chất nh vậy [62].
2
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
Hợp chất thứ sinh có có 3 con đờng trao đổi chính [18]:
Acid shikimic: phenol, lignin, alkaloid.
Acid mevalonic: terpen, steroid, alkaloid.
Deoxyxylulose: terpen, steroid, alkaloid.
1.1.1 Các hợp chất phenol [11, 47]
Đây là nhóm hợp chất lớn nhất trong các hợp chất thứ sinh thực vật. Các
nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8.000 hợp chất phenol tự nhiên [24]. Đặc
điểm cấu trúc chung của nhóm này là trong phân tử có vòng thơm (vòng
benzene) gắn trực tiếp với một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH). Vì vậy chúng là
những rợu bậc bốn và đợc đặc trng bằng tính acid yếu.
1.1.1.1 Phân loại
Dựa vào thành phần và cấu trúc của phenol, ngời ta chia chúng thành 3
nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol. Phân loại này
dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó C
6
là nhóm phenyl, C
1
là
nhóm methyl, C
2
là nhóm acetyl, C
3
là nhóm thế có 3 carbon, C
4
là nhóm thế có
4 carbon.
C
6
(phenol đơn giản, benzoquinone), C
6
-C
1
(acid phenolic), C
6
-C
2
(acetophenone, phenylacetic acid), C
6
-C
3
(acid hydroxycinnamic, coumarin,
phenylpropene, chromone), C
6
-C
4
(naphthoquinone), C
6
-C
1
-C
6
(xanthone), C
6
-
C
2
-C
6
(stilbene, anthraquinone), C
6
-C
3
-C
6
(flavonoid, isoflavonoid), (C
6
-C
1
)
2
(tannin thủy phân), (C
6
-C
3
)
2
(lignan, neolignan), (C
6-
C
3
-C
6
)
2
(biflavonoid), (C
6
-
C
3
)
n
(lignin), (C
6
)
n
(catechol melanin), (C
6
-C
3
-C
6
)
n
(tannin ngng tụ) [23, 25, 30].
Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất
phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân.
Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng.
3
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
Hình 1.1. Một số hợp chất phenol
1.1.1.2 Tính chất hoá học
Các hợp chất phenol có cấu tạo và tính chất đa dạng nhng do có những
thành phần cấu trúc chung nên chúng có một số tính chất chung:
Phản ứng của nhóm hydroxyl.
Phản ứng phá vòng benzene.
Phản ứng tạo phức với kim loại.
Phản ứng este hoá.
1.1.1.3 Vai trò của các hợp chất phenol trong thực vật
Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng
không thể lẩn trốn đợc kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này.
4
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
Nhìn chung vai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng
khuẩn, kháng dinh dỡng của chúng.
Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa
nh đỏ, xanh, tím; đặc tính chống oxy hóa (antioxidant) hay tạo phức với kim
loại; tạo ra các tín hiệu thông tin giữa phần ở trên cũng nh dới mặt đất, giữa các
cây với các sinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV)
từ mặt trời. Khả năng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống
dới nớc lên cạn hoàn toàn.
Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi các hợp chất phenol không chỉ là
bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình điều
hoà ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trởng và phát triển bình thờng [25, 30].
Các flavonoid nh flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trong việc
điều chỉnh sự phân bố năng lợng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang
hợp. Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả,
hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa.
1.1.2 Flavonoid [8, 11, 47]
Flavonoid là sản phẩm của con đờng acid shikimic, chúng có khung
carbon chung là C
6
- C
3
- C
6
. Flavonoid gồm hai vòng benzene A, B và vòng
pyran C, trong đó A kết hợp với C tạo thành khung chroman.
O
A
C
B
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
Flavonoid là một trong các nhóm polyphenol thờng gặp ở thực vật, với
hơn 4.500 hợp chất, phần lớn dễ tan trong nớc và có màu vàng nên đợc gọi là
5
Cấu trúc flavonoid
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
flavonoid (flavus - tiếng Latin, có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên không phải
các flavonoid đều có màu vàng, một số sắc tố xanh, đỏ, tím hoặc không màu
cũng đợc xếp vào nhóm flavonoid nếu chúng có chung đặc điểm cấu tạo hoá
học.
1.1.2.1 Phân loại
Trong tự nhiên, flavonoid tồn tại ở hai dạng: dạng tự do và dạng liên kết
với đờng (glycoside). Các glycoside khi thuỷ phân bằng acid hay enzyme sẽ
giải phóng ra đờng và aglycone.
Flavonoid đợc chia thành các nhóm phụ dựa theo mức độ oxy hoá của
khung chroman hay sự có mặt của các nối đôi giữa C2, C3 và nhóm carbonyl ở
C4 của vòng C nh: flavone, flavonol, catechin, leucoanthocyanidin,
anthocyanidin, chalcone và aurone
Công thức cấu tạo của một số aglycone flavonoid:
OOH
O
R
1
OH
R
2
OOH
O
R
1
OH
R
2
R
OH
Flavon
Flavonol
1.1.2.2 Tính chất vật lý và hóa học
Tính chất vật lý
Tính chất vật lý là cơ sở để lựa chọn những phơng pháp phân lập, phân
tích và xác định các hợp chất flavonoid. Các dẫn chất flavon có màu vàng rất
nhạt, flavol vàng nhạt đến vàng, chalcone và auro vàng đậm đến đỏ cam. Các
chất thuộc nhóm isoflavone, flavanol, isoflavanone, flavanone,
leucoantoxyanidin, catechin không màu. Các dẫn chất anthocyanidin có màu
thay đổi tùy theo pH môi trờng.
6
Flavone
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
Tính tan trong dung môi: khả năng hòa tan của flavonoid không giống
nhau, tùy thuộc vào số nhóm OH và các nhóm thế khác của chúng. Flavonoid
glycoside không tan trong ether, tan đợc trong nớc nóng, tốt nhất là cồn nóng.
Các dẫn xuất 7-hydroxy thờng dễ tan trong kiềm loãng.
Một đặc điểm quan trọng của flavonoid là có khả năng hấp thụ tia tử
ngoại. Nguyên nhân của sự hấp thụ này là do hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra
bởi hai vòng benzene A, B và vòng pyran C. Flavonoid có hai dải hấp thụ cực
đại, giải 1 ở bớc sóng > 290nm, giải 2 ở bớc sóng 220 - 280nm.
Tính chất hoá học
Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học, vì vậy khả năng phản ứng hóa học
của chúng là rất lớn và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: vị trí các nhóm OH, hệ
thống nối đôi liên hợp và các nhóm thế. Dới đây là các phản ứng hoá học cơ bản
của flavonoid.
Phản ứng của nhóm OH: gồm phản ứng oxy hoá, phản ứng tạo
thành liên kết hydrogen, phản ứng este hoá.
Phản ứng của vòng thơm: phản ứng diazo hoá.
Phản ứng của nhóm carbonyl: phản ứng Shinoda, phản ứng tạo
phức với kim loại. Đây là phản ứng khử, có sự tham gia của kim loại nh Fe, Zn,
Mg và HCl. Sản phẩm có màu da cam, hồng hoặc đỏ. Phản ứng này đặc trng
cho các flavonoid có nhóm C=O ở vị trí C4 và nối đôi giữa C2 và C3. Điển hình
là flavonol, flavanone, flavanonol.
1.1.2.3 Tác dụng sinh học của flavonoid
Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú. Các cơ
chế hóa học của chúng có nhiều điểm còn cha sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đóng
vai trò quyết định là tác dụng chống oxy hóa. Nhờ đó flavonoid có thể triệt tiêu
gốc tự do có hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con ngời phòng chống
bệnh tật.
7
Nguyễn Minh Thắng Luận văn cao học khoá 2007-2009
Tác dụng chống oxy hoá
Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hoá dây chuyền sinh
ra bởi gốc tự do hoạt động. Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ
thuộc vào đặc điểm cấu tạo hoá học của từng chất flavonoid cụ thể. Do bản chất
cấu tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc trong cơ thể động
vật chịu tác động của các biến đổi oxy hoá khử, bị oxy hoá từng bớc và tồn tại ở
dạng hydroxyl, semiquinone, quinone. Semiquinone hoặc quinone là những gốc
tự do bền vững, gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu là A
r
O
*.
Chúng có thể nhận điện tử
và hydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinone. Các chất này
có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh
lý và bệnh lý để triệt tiêu chúng.
Sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng nh
các polyphenol làm cho chúng có khả năng tơng tác với các protein. Tơng tác
này có thể làm hoạt hoá hay ức chế hoạt động của enzyme. Tác dụng của
flavonoid lên các enzyme là một trong những cơ sở hoá sinh để định hớng cho
việc sử dụng các chất flavonoid để chữa bệnh.
Tác dụng chống ung th
Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid có khả
năng chống ung th. Các flavonoid có tác dụng kìm hãm các enzyme oxy hóa,
kìm hãm quá trình đờng phân, quá trình hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân,
hạn chế sự phá vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thờng trong tế bào.
Tác dụng làm bền thành mạch
Nhiều flavonoid có hoạt tính của vitamin P có tác dụng làm tăng sức bền
và tính đàn hồi của thành mao mạch. Củng cố và làm giảm tính thấm thành
mạch, bảo vệ thành mạch trong các bệnh làm tăng tính thấm thành mạch nh đái
đờng, trĩ, giãn tĩnh mạch
1.1.3 Tannin [21]
8
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét