CHUYỂN GEN TRÊN LAN HỒ ĐIỆP

Tuy nhiên, phạm vi và tính linh hoạt của
các phương pháp này còn hạn chế, kỹ
thuật chuyển gen có thể đưa ra một con
đường hiệu quả hơn các phương thức
thông thường cho phép đưa các tính trạng
đặc biệt vào Lan Hồ Điệp như khả năng
tổng hợp sRNA kháng virus gây cháy lá,
khả năng tự tổng hợp wasabi (mù tạc) để
kháng bệnh, hay mang gen kháng
acetylene giúp hoa lâu tàn.



Với mục tiêu bước đầu thử nghiệm quy
trình tiến hành biến nạp plasmid p35SGUS-
INT và pBAR-GUS vào Lan Hồ Điệp bằng
phương pháp gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens và phương pháp
trực tiếp bằng súng bắn gen nhằm tạo tiền đề
cho các nghiên cứu chuyển gen mục tiêu về
sau.


2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1.Vật liệu và môi trường nuôi cấy
2.1.2.Chủng vi khuẩn và plasmid sử dụng
trong chuyển gen bằng phương pháp
gián tiếp
2.1.3.Súng bắn gen và plasmid sử dụng
trong phương pháp chuyển gen trực tiếp


2.1.1.Vật liệu và môi trường nuôi cấy

PLB (Protocorm Like Body) có nguồn gốc
từ lá của giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis
amabilis L. được nuôi trên môi trường HY
bổ sung 30 g/l glucose, NAA 0,5 mg/l và
BAP 2 mg/l bằng phương pháp lỏng tĩnh
trong 2 tháng. Lát mỏng (1 – 2 mm) của các
PLB này được sử dụng làm mẫu cấy trong
tất các thí nghiệm chuyển gen.


2.1.2.Chủng vi khuẩn và plasmid sử dụng
trong chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp

Chủng A.tumefaciens C58pGV2260
(Debleare và cộng sự, 1985) mang
plasmid p35SGUS-INT (Vancanneyt và
cộng sự) chứa gen nptII và gen uidA (gusA)
(hình 1A) có chèn một vùng intron vào đầu
N-terminal của trình tự mã hóa chỉ cho phép
biểu hiện hoạt tính GUS trong tế bào thực
vật và không biểu hiện trong tế bào vi
khuẩn.


Hình 1: C u trúc vùng T-DNA c a plasmid p35SGUS-INT (A) và s đ plasmid ấ ủ ơ ồ
pBAR-GUS (B). RB: l ph i, LB: l trái, P-35S: promoter 35S, T-35S: terminator 35S, ề ả ề
nptII: neomycin phosphotransferase, gus: β-glucuronidase, T-nos: nopaline synthase,
iAdh1: intron, tNOS: terminator NOS, BAR: mã hóa cho enzyme phosphinothricin
acetyltransferase


2.1.3.Súng bắn gen và plasmid sử dụng
trong phương pháp chuyển gen trực tiếp

Sử dụng hệ thống máy bắn gen BiolisticTM
PDS-1000/He (Bio-Rad) để biến nạp
plasmid pBAR-GUS có gen uidA (gusA) và
gen bar (gen kháng PPT trong thành phần
thuốc diệt cỏ ) (hình 1B).


2.2.PHƯƠNG PHÁP
2.2.1.Chuyển gen bằng phương pháp gián
tiếp sử dụng vi khuẩn A.tumefaciens
2.2.2.Chuyển gen bằng phương pháp trực
tiếp sử dụng súng bắn gen
2.2.3.Thử GUS


2.2.1.Chuyển gen bằng phương pháp gián
tiếp sử dụng vi khuẩn A.tumefaciens

Vi khuẩn A.tumefaciens được nuôi cấy lắc
qua đêm ở 22
o
C trong môi trường LB lỏng bổ
sung rifampicin (50 mg/l) và kanamycin (50
mg/l). Pha loãng sinh khối vi khuẩn bằng MS
(OD600 = 0,8) và bổ sung acetosyringone
(AS) sao cho nồng độ cuối cùng là 25 – 300
μM.

Sau 4 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn ở
22
o
C ủ tối, các mẫu cấy được đem đi thử
GUS.


2.2.2.Chuyển gen bằng phương pháp
trực tiếp sử dụng súng bắn gen

Vi đạn được chuẩn bị theo phương pháp của Sanford
và cộng sự (1993) với nồng độ 500 µg tungsten/0,5
µg DNA plasmid. Mẫu PLB được xếp kín thành một
vòng tròn trên đĩa Petri chứa môi trường HY rắn bổ
sung 30 g/l glucose, NAA 0,5 mg/l và BAP 2 mg/l.

Thực hiện quy trình bắn gen với áp suất khí helium
1100 psi và các khoảng cách đặt mô mục tiêu trong
buồng bắn lần lượt là 6, 9, 12 cm. Sau khi bắn được
48 giờ, các mẫu được đem đi thử GUS.

Xem chi tiết: CHUYỂN GEN TRÊN LAN HỒ ĐIỆP