Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
5
Trong cùng thời gian, tại phân viện KHVN ở thành phố Hồ Chí Minh và muộn hơn
nữa là ở tại Đại học Nông Nghiệp I (ĐHNNI), Hà Nội và viện Khoa Học Kỹ Thuật
Nông Nghiệp Việt Nam (KHKTNNVN) và các phòng thí nghiệm cấy mô và tế bào
củng được thành lập và chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây. Đến nay
chúng ta đã có rất nhiều phòng thí nghiệm cấy mô không những ở các trường Đại
học, các viện nghiên cứu (viện Di Truyền Nông nghiệp /DTNN/, viện Rau quả trung
ương /RQTƯ/) mà cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (Yên Bái, Hưng Yên, Thanh
Hoá, Nghệ Tónh, Cần Thơ, …).
Từ giữa những năm 80 trở lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy
mô và tế bào thực vật được phát triển mạnh. Những kết quả khích lệ đã đạt được
trong lónh vực vi nhân giống khoai tây (viện Công Nghệ Sinh Học /CNSH/, ĐHNNI,
viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện CNSH, ĐHNNI, viện DTNN, viện
KHKTNNVN, viện RQTƯ) một số cây hoa phong lan (phân viện CNSH thành phố
Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm chướng (viện CNSH, viện DTNN) và cây công
nghiệp như bạch đàn (viện DTNN, viện Lâm Nghiệp). Một số kết quả bước đầu đã
được ghi nhận trong lónh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng tế bào kháng bệnh
(Lê Bích Thủy và cs,,1994), chọn dòng chòu muối, chòu mất nước (Nguyễn Tường
Vân và cs,, 1994; Đinh Thò Phòng và cs,, 1994). Các kết quả về dung hợp cây lai tế
bào chất và chuyển gen lục lạp củng thu được kết quả lí thú (Nguyễn Đức Thành và
cs,, 1988; Nguyễn Đức Thành và cs,,1993, 1997). Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng
thuần đã được ứng dụng nhiều ở viện CNSH và DTNN. Nuôi cấy các cây dược liệu
quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học
quan trọng cao cũng đã (Phan Huy Bảo và Lê Thò Xuân, 1988) và đang được phát
triển (Phan Thò Bảy và cs. 1995).
1.2.1.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro
Cho tới nay việc nhân giống in vitro đã được áp dụng cho nhiều loài cây (350
loài), Murashige (1974) đã chia quy trình nhân giống làm 4 giai đoạn:
- Nuôi cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
6
- Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện in vitro.
- Tạo cây con hoàn chỉnh, huấn luyện cây con.
- Phục hồi, chuyển cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên.
1.2.1.4 Các phương pháp nhân giống in vitro
a) Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào
thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên).
Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy
đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung
chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời
gian nuôi cấy nhất đònh mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp
tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con dïc
chuyển dần ra đất và thích nghi bình thường.
b) Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân
hoá của các tế bào đã phân hoá. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự
hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh
trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo.
Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng
nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính
giống như cây me. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi
hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trûng, tuy nhiên mức độ biến dò tế bào soma lại cao hơn.
c) Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc
có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ gọi là tế bào
đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
7
Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường tế bào có khả
năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học.
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được
tách ra và trải trên môi trường thạch.
Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm
tế bào mô sẹo.
Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinine/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả
năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh.
d) Nuôi cấy protoplast- chuyển gen
Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống
và duy trì đầy đủ các chức năng sẳn có.
Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế
bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thể ở thực vật).
Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung
hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá
trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay
khác loài.
e) Nuôi cấy hạt phấn đơn bội
Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành
mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.
1.2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
a) Sự lựa chọn mẫu cấy
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
8
Nói chung, mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất đònh sẽ tái sinh tốt
hơn mô già của cùng một cây. Chồi hoa non hay cụm hoa non cũng thường có khả
năng tái sinh rất tốt.
Mẫu cấy thích hợp cho nuôi cấy in vitro phải có tỉ lệ lớn mô phân sinh hiện
diện hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn thể.
b) Môi trường nuôi cấy
Công thức môi trừơng của Murashige và SKoog (1962, MS) là thích hợp cho
phần lớn các môi trường nuôi cấy in vitro. Để tạo chồi nách thường yêu cầu nồng độ
tương đối thấp của auxin và cytokinine.
Sự lựa chọn môi trường rắn hay môi trường lỏng là rất cần thiết. Agar đỡ cây
và cho phép sự thoáng khí, nhưng có thể làm giảm sự tiếp xúc của cây mầm để hấp
thu dinh dưỡng. Có thể sử dụng môi trường lỏøng trên máy lắc khoảng 30vòng/phút
hay sử dụng môi trường lỏng với dung tích nhỏ trong bình chứa có lắc hoặc không
lắc.
c) Điều kiện nuôi cấy
♦ Ánh sáng
Mẫu cấy ở trên môi trường có chứa một nguồn năng lượng sẳn có là đường,
được sử dụng ít hay nhiều là tùy khả năng quang hợp của cây.
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thụ đóng vai trò quan
trọng tạo hình cây nuôi cấy in vitro. Ánh sáng đỏ và xanh của quang phổ trông thấy
ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro.
Việc nuôi cấy mô tốt nhất trong điều kiện ánh sáng khoảng 1000lux. Trong
giai đoạn chuẩn bò cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm, cần cường độ
ánh sáng trong khỏang từ 3000lux đến 10,000lux.
♦ Nhiệt độ
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
9
Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy
in vitro. Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại cây trồng trong khoảng 20 – 25
o
C. Một số
loài cây cần có nhiệt độ tối ưu để tạo hình.
d) Môi trường in vitro
Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy,
có ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển hình thái của cây in vitro. Một số vấn đề
của cây in vitro là mức độ quang hợp thấp, không cân bằng CO
2
, mức hấp thu và
vận chuyển dinh dưởng hạn chế, … Vì vậy, cây con in vitro thường sinh trưởng
chậm. Nên khi tiến hành nhân giống in vitro cần phải tiến hành những vấn đề trên.
1.2.1.6 Những trường hợp thường gặp trong nuôi cấy
a) Tính bất đònh về mặt di truyền
Tính bất đònh về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh
trưởng. Tần số biến dò thường khác nhau và không lặp lại .
Việc nuôi cấy mô sẹo tế bào đơn thường cho tần số biến dò cao hơn so với
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng .
Tần số biến dò xảy ra phụ thuộc vào các yếu tố: kiểu di truyền hay giống cây
trồng, loại mô cấy và số lần cấy chuyền nhiều hay ít.
b) Sự nhiễm mẫu
♦ Mẫu nhiễm virus: Nên sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh thì có
thể loại bỏ được virus.
♦
Mẫu nhiễm vi khuẩn
Có thể sử dụng kháng sinh như Penicillin, Ampicillin … với nồng độ khác
nhau tuỳ vật liệu nuôi cấy .
♦
Sự nhiễm mẫu do nấm
Không giữ mẫu được do bào tử phát tán mạnh.
♦ Sự hoá thuỷ tinh thể
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
10
Là một dạng bệnh lý của cây, thân lá cây trong suốt và chứa nhiều nước, khó
nhân giống. Một số phương pháp hạn chế quá trình hoá thuỷ tinh thể bằng cách tăng
nông độ đường hoặc giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy, tạo thông gió,
tăng ánh sáng hay giảm nhiệt độ phòng nuôi cấy …
♦ Sự hoá nâu
Làm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của cây. Do trong mẫu nuôi cấy
mô chứa nhiều chất tannin hay hydroxyphenol (có nhiều trong mô già hơn mô non)
gây độc cho cây. Chống hoá nâu bằng cách thêm vào môi trường nuôi cấy các chất
hấp thu và khử độc như than hoạt tính (1 – 2g/l) vài giờ trước khi cấy, ngoài ra có
thể sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô non trẻ, gây vết thương nhỏ khi vô trùng mẫu cấy
hoặc nhiễm mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng từ thấp đến quá cao.
1.2.1.7 Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy tế bào
Sự hiện diện của các hormone thực vật đã được khám phá ra từ cuối thế kỷ
20. Có nhiều công trình nghiên cứu nối tiếp nhau làm nổi bật sự hiện diện của
chúng, nhưng chúng chỉ được nhận dạng một thời gian sau. Chính chất auxin được
khám phá đầu tiên vào năm 1934, tiếp đến là các chất gibberelin và chất cytokinine
vào những năm 1950. Ba loại hormone này có một hoạt động kích thích sự chuyển
hoá của tế bào; người ta cũng có những chất ức chế có nguồn gốc phenol. Sau cùng
chất ethylen, tạo nên khí, đã được nhân ra như một chất điều hoà tăng trưởng một
khi các phương tiện về đònh lượng đã cho phép người ta dò tìm ra chúng trong các cơ
quan thực vật. Chất này có thể có một hoạt động kích thích hoặc ức chế tùy theo
liều lượng sử dụng.
a) Auxin
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
11
Auxin được khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về
đường cong của loài coleoptiles họ graminae. Tên của nó như vậy vì nó cần thiết
cho hoạt động của tế bào.
Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là: C
10
H
9
O
2
N, tên của
nó là axid indole - β - acetique.
♦ Tính chất sinh lí của auxin
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lí, hoạt động của nó tuỳ thuộc vào
nồng độ và sự hỗ tương qua lại của chúng với các chất điều hoà khác. Trong lúc
khảo sát các hiệu quả riêng lẻ khác, chúng ta có thể lưu ý:
- Một tác động rỏ ràng trên sự kéo dài tế bào.
- Một sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào.
- Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hoá và đặc biệt nhất là trên sự
tổng hợp ARN robosomique.
- Một sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc
cambium.
- Một hoạt động trên sự tổng hợp chất ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ;
chất ethylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỉ lệ chất auxin, ít nhất ở
mức độ chuyên chở.
- Một hoạt động các phản ứng về tăng trưởng và trong các sự hổõ tương giữa
các cơ quan với nhau, đặc biệt là hiện tượng về tính ưu thế của chồi non.
- Một hiệu quả trễ trong sự rụng lá và trái.
- Cuối cùng một hoạt động ra rễ rõ ràng đã được khám phá từ lâu trong lónh
vực thực tiễn, ở đây các hormone ra rễ thường được sử dụng.
Các hiệu quả này không thể do một tác động duy nhất của auxin, các hiệu
quả khác chứng tỏ rằng: các nồng độ tối ưu thì khác nhau, đối với mỗi loại tác động;
giá trò tối ưu này có thể xê dòch tuỳ theo nồng độ của các chất điều hoà khác.
♦ Auxin trong cây trồng
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
12
Tất cả các cây trồng đều tổng hợp được chất auxin dạng tổng hợp tuỳ theo
giai đoạn phát triển của chúng. Sự tinh luyện chất auxin ở mức độ lá rất non, trong
các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non.
Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ
ràng được nhìn rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quá trình chuyển
vận này, chúng bò thoái hoá bởi sự auxin- axydases, điều này cho thấy các nồng độ
auxin thì luôn luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp ra chúng. Như vậy auxin
hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để
bảo đảm sự nhân giống và sự kéo dài tế bào.
♦ Các chất auxin tổng hợp
Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau
và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm. Một vài chất này đã thể hiện
các đặt tính tương tự như các đặc tính của chất auxin, nhưng thường với các liều
lượng thấp hơn, hơn nữa, chúng ít bò kiểm soát bởi các enzyme; chúng có thể có một
hoạt động kéo dài.
Trong số những chất được sử dụng, chúng ta có thể kể ra các chất chính sau
đây:
- Axid indolylbutirique (AIB)
- Axid naphtylacetique (ANA) hoặc là các chất dẫn xuất của chúng như:
. Axid naphtyloxyacetique (ANOA)
. Axid naphtlacetamine (NAD)
. Axid 2,4 dichrolophen - oxyacetique (2,4 D)
Trong thực tế, auxin có thể được sử dụng, nó ít độc nhưng cũng ít hiệu quả
bởi vì nó bò kiểm soát rất nhanh, chính vì vậy mà các chất tổng hợp đã thay thế chất
auxin, mặt dù các nguy hại về độc tính thì cao hơn.
Trong những ứng dụng thực tiễn, các chất có cấu trúc auxin được sử dụng để
giâm cành, chúng cũng được tìm thấy trong các ứng dụng quan trọng như ngành cây
ăn quả để làm sáng các quả, sự đậu quả hoặc còn để làm chậm sự thu hoạch quả.
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
13
Trong lónh vực nuôi cấy in vitro, những chất giống được sử dụng và auxin đã
chiếm một vò trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng được nghiên cứu thuộc về
lónh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ.
b) Gibberelin
Gibberelin, cũng như chất auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng.
Những sự quan sát đầu tiên (1926) đã được thực hiện trên các cây lúa được tấn công
bởi một loại nấm (gibberella); các thân lúa này có các đốt dài hơn nhiều. Các dòch
chiết nhày của loại nấm này cũng gây ra cùng triệu chứng trên; từ đó ý tưởng về sự
hiện diện của một chất có trách nhiệm về các hiệu quả này.
Chất Gibberela đầu tiên được nhạân dạng là axid gibberelique hoặc là GA
3
.
♦ Tính chất sinh lí của gibberelin.
Một hoạt động rõ ràng trên sự kéo dài của các đốt cây.
Trong nuôi cấy mô, gibberelin có tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng,
nếu thiếu gibberelin các đỉnh sinh trưởng thể hiện dạng hình cầu tạo nên các mắc
cây.
Có một hiệu quả kích thích trên sự chuyển hoá, bởi vì chúng làm thuận lợi
cho sự tổng hợp chất enzyme ly giải.
Một hoạt động phức tạp trên sự ra hoa: thực tế, trong trường hợp cảm ứng
hoa, các gibberelin thường là các chất ức chế; trái lại, đối với các cây cần lạnh để
ra hoa, sự ứng dụng gibberelin cho phép cây ra hoa mà trong lúc vắng nhiệt độ lạnh.
Các gibberelin cũng có một tác động trên sự đậu trái của các trái không hạt.
Một hoạt động cũng phức tạp trong việc làm thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các
hạt giống.
Cuối cùng là trong lónh vực sinh tạo cơ quan thực vật, gibberelin cho thấy các
hoạt động đối kháng: chúng dường như đối ngòch với hiện tượng phân hoá tế bào.
Trong sự nuôi cấy in vitro, gibberelin không thể sử dụng vào mục đích này nhưng
chúng sẽ tìm thấy công dụng của chúng trong các mô thực vật đã có tổ chức.
♦ Gibberelin trong cây trồng
Luận văn tốt nghiệp
SVTH: Nguyễn Thò Ngọc Download» Agriviet.Com
14
Gibberelin được tìm thấy trong tất cả các loài cây và trong các loài nấm, ở
đây chúng được phân phối không đồng đều. Trong cây trồng, một vài loài cây chỉ
có một chất, các loài cây khác có thể có nhiều chất gibberelin.
Dạng thức tổng hợp của gibberelin là ở trên các lá rất non trong các chồi
đang hoạt động, ở đầu ngoài của rễ cây và ở mức độ các phôi.
c) Các cytokinine
Cytokinine được khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro. Người ta
biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc thêm nước dừa sẽ gây ra một hiệu quả
làm thuận lợi cho việc phân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Những
nghiên cứu được thực hiện để tìm cách khám phá ra yếu tố trách nhiệm của hiệu
quả này, đã đưa đến việc cô lập một phức chất hoạt động có nguồn gốc purine,
nhưng chất này không thể nhận dạng được. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập được
một chất rất là hoạt động mà người ta đặt tên là kinetine, do ADN biến chất.
Cytokinine là các chất adenine được thay thế, chất này được người ta biết
qua hai nhóm nội sinh là:
- Zeatine.
- Isopentenylalenine (IPA), cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp.
Có hai loại được sử dụng nhiều nhất là:
+ Kinetine (6 furfuryl – aminopurine)
+ Benzyladenine (BAP) (6 – benzyl – aminopurine)
Các adenine được thay thế khác được dùng dưới dạng tự do hoặc liên kết với
một chất đường.
♦ Tính chất sinh lí của cytokinine
Cytokynine rất hoạt động và với hình ảnh của hai nhóm trên, chúng biểu hiện
nhiều tính chất trong đó có các tính chất sau:
- Một hiệu quả rất rõ trong sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng
cần thiết nhưng chúng không thể có hiệu quả nếu vắng mặt auxin.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét