công nghệ tạo động vật chuyển gen

Sử dụng phương pháp này, các gen chuyển có chiều dài trên 50 kb
Sử dụng phương pháp này, các gen chuyển có chiều dài trên 50 kb
của virus, sinh vật tiền nhân , thực vật, động vật không xương
của virus, sinh vật tiền nhân , thực vật, động vật không xương
sống hoặc động vật có xương sống có thể được chuyển vào
sống hoặc động vật có xương sống có thể được chuyển vào
genome của động vật có vú và chúng có thể được biểu hiện ở cả
genome của động vật có vú và chúng có thể được biểu hiện ở cả
tế bào sinh dưỡng và tế bào sinh sản.
tế bào sinh dưỡng và tế bào sinh sản.
II. Công nghệ tạo động vật chuyển gen
II. Công nghệ tạo động vật chuyển gen


Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp
Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp
và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội
và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội
dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen
dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen
mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật;
mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật;
tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật;
tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật;
nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao);
nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao);
phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và
phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và
tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản
tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản
xuất động vật chuyển gen.
xuất động vật chuyển gen.

Hình 4.1: Sơ đồ tạo động vật chuyển gen

1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp
1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp
gen biểu hiện trong tế bào động vật
gen biểu hiện trong tế bào động vật
1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn
1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn
•
Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào
Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào
vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và
vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và
tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng. Các công
tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng. Các công
cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt
cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt
tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò
tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò
(probe), vector và tế bào vật chủ. Tế bào vật chủ thường được
(probe), vector và tế bào vật chủ. Tế bào vật chủ thường được
sử dụng là tế bào vi khuẩn
sử dụng là tế bào vi khuẩn
E.coli
E.coli
và vector thường được sử dụng
và vector thường được sử dụng
là plasmid.
là plasmid.
•
Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA mẫu
Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA mẫu
chứa hàng triệu gen. Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu
chứa hàng triệu gen. Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu
chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng
chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng
một loại enzyme hạn chế. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt
một loại enzyme hạn chế. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt
có mang gen mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các
có mang gen mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các
đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid
đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid
sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp.
sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp.
Sau đó các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi
Sau đó các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi
khuẩn
khuẩn
E.coli
E.coli
và các tế bào vi khuẩn tiến hành sinh trưởng.
và các tế bào vi khuẩn tiến hành sinh trưởng.

Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen
Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen
mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò. Chúng được nuôi cấy
mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò. Chúng được nuôi cấy
trong môi trường thích hợp để sinh trưởng phát triển tạo ra hàng
trong môi trường thích hợp để sinh trưởng phát triển tạo ra hàng
triệu bản sao của vector chứa gen này. Vector chứa gen này sẽ
triệu bản sao của vector chứa gen này. Vector chứa gen này sẽ
được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách
được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách
chiết. Phương pháp này có thể tạo ra hàng triệu bản sao của gen
chiết. Phương pháp này có thể tạo ra hàng triệu bản sao của gen
mong muốn mà không bị nhiễm bởi các gen khác. Gen chuyển có
mong muốn mà không bị nhiễm bởi các gen khác. Gen chuyển có
nguồn gốc từ genome này chứa các đoạn exon mã hoá và các
nguồn gốc từ genome này chứa các đoạn exon mã hoá và các
đoạn intron không mã hoá (Hình 4.2).
đoạn intron không mã hoá (Hình 4.2).
Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển

Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm
Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm
biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tác động
biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tác động
của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch
của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch
đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ
đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ
sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA). DNA
sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA). DNA
bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không
bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không
chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2). Hoặc từ sản
chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2). Hoặc từ sản
phẩm protein, có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc
phẩm protein, có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc
trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein. Sau đó có
trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein. Sau đó có
thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn.
thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn.



1.2.Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào
1.2.Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào
động vật
động vật
•
Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các
Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các
vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài
vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài
khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm
khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm
bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase. Tất cả các thành
bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase. Tất cả các thành
phần của gen có thể được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành
phần của gen có thể được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành
một cấu trúc gen chuyển biểu hiện (Hình 4.3).
một cấu trúc gen chuyển biểu hiện (Hình 4.3).
•
Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng
Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng
cách bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết
cách bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết
các enzyme hạn chế khác nhau. Trình tự polylinker cho phép có
các enzyme hạn chế khác nhau. Trình tự polylinker cho phép có
thể xen vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng.
thể xen vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng.
•
Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai
Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai
trò điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều hoà cũng có
trò điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều hoà cũng có
thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của
thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của
gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự
gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự
biểu hiện của gen.
biểu hiện của gen.





Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như
Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như
methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin,
methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin,
ß-lactoglobulin, adiposite P2 hoặc từ virus động vật như Simian
ß-lactoglobulin, adiposite P2 hoặc từ virus động vật như Simian
virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)
virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)
Hình 4.3: Sơ đồ cấu trúc gen chuyển biểu hiện
enhancer: gen tăng cường
ATG: vị trí khởi đầu phiên mã
SIG: trình tự tín hiệu
AAA: đuôi polyA



2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen
2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen
•
Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là
Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là
trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của
trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của
tinh trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau. Ở giai
tinh trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau. Ở giai
đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của
đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của
động vật nhờ sự tái tổ hợp DNA của tinh trùng và của trứng. Do
động vật nhờ sự tái tổ hợp DNA của tinh trùng và của trứng. Do
tế bào phôi chưa phân chia và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được
tế bào phôi chưa phân chia và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được
biến nạp vào giai đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả
biến nạp vào giai đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả
tế bào sinh sản của động vật trưởng thành sau này.
tế bào sinh sản của động vật trưởng thành sau này.
•
Ðối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương
Ðối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương
pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng
pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng
cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống
cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống
nghiệm. Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân.
nghiệm. Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân.

Ðối với cá, giai đoạn biến nạp thích hợp là phôi ở giai đoạn 1-4 tế
Ðối với cá, giai đoạn biến nạp thích hợp là phôi ở giai đoạn 1-4 tế
bào. Giai đọan này được tạo ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch
bào. Giai đọan này được tạo ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch
bằng phương pháp sử dụng kích dục tố (kích thích tố trong nhau
bằng phương pháp sử dụng kích dục tố (kích thích tố trong nhau
thai của người (HCG) hoặc não thuỳ thể cá chép ), rồi thụ tinh
thai của người (HCG) hoặc não thuỳ thể cá chép ), rồi thụ tinh
nhân tạo.
nhân tạo.
3. Chuyển gen vào động vật
3. Chuyển gen vào động vật
•
Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang
Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang
được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen
được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen
bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách
bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách
sử dụng vector virus
sử dụng vector virus

4. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động
4. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động
vật bậc cao)
vật bậc cao)
•
Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống
Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống
nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi
nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi
phôi (blastocyst). Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị
phôi (blastocyst). Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị
bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con. Những phôi này
bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con. Những phôi này
được cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả
được cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả
(pseudopregnant) để phát triển thành cá thể con.
(pseudopregnant) để phát triển thành cá thể con.
•
Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này.
Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này.
•
Tuy nhiên ở cá, trứng sau khi thụ tinh màng thứ cấp (chorion)
Tuy nhiên ở cá, trứng sau khi thụ tinh màng thứ cấp (chorion)
dày lên, rất dai và dính gây trở ngại cho việc định vị chính xác
dày lên, rất dai và dính gây trở ngại cho việc định vị chính xác
mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNA vào
mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNA vào
trứng (Hình 4.4A). Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất
trứng (Hình 4.4A). Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất
ngắn trong khi đó việc vi tiêm đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ và
ngắn trong khi đó việc vi tiêm đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ và
chính xác. Ðể khắc phục các nhược điểm này, người ta có thể
chính xác. Ðể khắc phục các nhược điểm này, người ta có thể
tiến hành loại màng thứ cấp (Hình 4.4B), kéo dài giai đoạn phôi
tiến hành loại màng thứ cấp (Hình 4.4B), kéo dài giai đoạn phôi
1-4 tế bào và ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột.
1-4 tế bào và ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột.

Xem chi tiết: công nghệ tạo động vật chuyển gen