Công nghệ Protease

Trong nhiều trường hợp các tính chất protein thực phẩm được cải thiện nhờ
thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease. Sự thủy phân hạn chế có
tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan và khả
năng khuếch tán đến bề mặt phân chia).

Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin)
1.2. Phân loại protease
 Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống
phân loại các nhóm enzyme;
 Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase;
 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
 Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc
một tripeptit;
 Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi
polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid.
 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
 Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt
động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ:
7
chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme
động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm
hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN. Các
serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện
tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
 Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như
papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh
trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính,
có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
 Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin,
chymosin, cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm
carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH
trung tính.
 Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm
thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các
metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ
giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
 Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
 Protease acid: pH = 2 – 4;
 Protease trung tính: pH = 7 – 8;
 Protease kiềm: pH = 9 – 11.
1.3. Nguồn thu protease vi sinh vật
Trong công nghiệp protease có thể thu từ nhiều nguồn chủ yếu từ vi sinh vật như:
vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn.
1.3.1.Vi khuẩn:
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm
59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease
8
của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các
liên kết peptid trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi
khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và
kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 8)
và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein
thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các
protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm.
Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và
một số giống thuộc chi Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử
từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH
rộng 7 – 12.
1.3.2.Nấm mốc:
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng
tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ
yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng
có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất
fomat.
1.3.3.Xạ khuẩn:
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn
và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng
hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus
9

Hình 3: Bào tử xạ khuẩn
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân
tới 90% liên kết peptit của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta
cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ,
chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S.
fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế
biến thịt.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
1.4. Thu nhận protease từ vi sinh vật
Sự thu nhận protease từ vi sinh vật trải qua các giai đoạn chính có thể tóm tắt
thành sơ đồ như sau:
Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease
10
1.4.1. Tuyển chọn chủng:
Yêu cầu tuyển chọn chủng tổng hợp được enzyme cần thiết, với lượng đáng
kể và hoạt tính cao. Đối với việc thu protease thì thu từ nguồn như nấm mốc, vi
khuẩn, xạ khuẩn.
Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất, nước, lương thực, thực
phẩm…Tuy nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp
được một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), người ta cần tiến hành gây đột biến
bằng phương pháp sinh học, lý, hóa học… để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợp
enzyme”. Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn cần được nhân giống và nuôi trong
điều kiện tối ưu để chúng sinh sản và phát triển tốt, tổng hợp nhiều enzyme.
1.4.2. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp
Protease:
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng
trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần
môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh
vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì
chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toả
của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị
cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ
chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,
Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
Về phương pháp nuôi cấy hiên nay người ta thường dùng hai phương pháp
sau:
 Nuôi bề mặt (môi trường nuôi dạng rắn) hay trên bề mặt dạng lỏng;
 Nuôi bề sâu (nuôi chìm) – môi trường nuôi dạng lỏng.
1.4.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme:
Tách chiết enzyme theo các công đoạn như sau:
 Phá vỡ màng tế bào để giải phóng enzyme: có thể dùng các phương pháp vật
lý, hóa học, cơ học…;
11
 Dùng dung môi chiết enzyme: thường dùng nước, NaCl, dung dịch đệm có pH
ổn định và phù hợp với enzyme;
 Lọc, ly tâm;
 Kết tủa enzyme: có thể dùng dung môi hữu cơ (ethanol, acetol), dùng muối,
điểm đẳng điện pH = pI;
 Ly tâm, tách tủa;
 Sấy kết tủa cho đến khô.
Qua các bước như trên ta thu được enzyme chưa tinh khiết, cần qua giai đoạn tinh
sạch enzyme để được enzyme tinh khiết. Có nhiều phương pháp tinh sạch như sau:
 Phương pháp thẩm tích Dialise: là phương pháp sử dụng màng lọc bán thấm
chỉ cho những chất có khối lượng phân tử nhỏ đi qua;
 Phương pháp kết tủa phân loại: thay đổi nồng độ chất kết tủa;
 Phương pháp điện di;
 Phương pháp lọc gel (gel Sephadex);
 Phương pháp sắc ký.
2. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
2.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa
2.1.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa [4]:
Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất. Các
sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến. Từ nguyên liệu sữa, người ta đã cho ra vô
vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau.
Sữa chứa hầu hết các men có trong tự nhiên. Các men này vào sữa theo tuyến
sữa và từ các vi sinh vật trong không khí hay dụng cụ chứa sữa như lipase, protease.
Protease tham gia vào quá trình thủy phân protein tạo thành các sản phẩm như
pepton, acid amin, Một số peptone được hình thành có thể gây vị đắng trong sữa.
Protease được hình thành tự nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toàn
khi thanh trùng ở nhiệt độ 76 ÷ 78
o
C.
Khi điều kiện vệ sinh không tốt, một số men tạo ra từ các nguồn vi sinh vật
xâm nhập vào gây tác hại đến sữa. Chúng có thể làm giảm nghiêm trọng chất lượng
của sữa ban đầu. Sự có mặt một số men trong sữa được dùng làm chỉ tiêu trong kiểm
tra chất lượng sữa.
12
Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù và
tính cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng
như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường.
Trong đó, mảng sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú và
chiếm một vị trí quan trọng trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm sữa. Có
thể kể ra đây là bơ, fomat, kefir, yoghurt,…do đó các enzyme sử dụng trong công
nghiệp sữa ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng, có thể kể đến như rennin
(chymosin), pepsin có thể làm đông tụ sữa được dùng trong sản xuất fomat, sữa đông
tụ…
2.1.2. Ứng dụng trong việc sản xuất fomat:

13
Hình 4: Sản xuất Fomat
Fomat là sản phẩm chế biến từ sữa có sử dụng quá trình lên men lactic. Đây là
môt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, bảo quản được lâu, rất phổ biến và thích
hợp khẩu vị người châu Âu, châu Mỹ.
Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳ
mức độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác. Quá
trình đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất fomat. Protease được thu nhận từ
một số vi sinh vật như Asp. candidus, P. roquerti, Bac. mesentericus,…
Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat
Nhóm Nguồn gốc Tên enzyme
Động vật
Dạ dày bê
Chymosin A, pepsin và
gastriscin
Dạ dày cừu Chymosin và pepsin
Dạ dày dê Chymosin và pepsin
Dạ dày heo Pepsin A, B và gastricin
Thực vật Cynara cardunculus
Cyprosin 1, 2, 3 hoặc
cardosin A, B
Vi sinh vật
Rhizomucor miehei
R. pusillus
Cryphonectria parasitica
Aspartic protease
Vi sinh vật chuyển gen
Chymosin từ bê
Aspergillus niger
Kluyveromyces lactis
Chymosine B
2.1.2.1. Rennin:
 Khái niệm chung:
 Năm 1951, Heinz khám phá ra enzyme đông tụ sữa ở dịch tiêu hoá
ngăn thứ tư dạ dày bê gọi là rennin.
 Rennin có trong dịch dạ dày của động vật đang bú mẹ (trâu, bò, dê…
mới đẻ), đặc biệt ngăn thứ tư dạ dày bê. Khi con vật lớn hơn 5 tháng
tuổi, bắt đầu ăn, hàm lượng rennin giảm dần và được thay thế bằng
pepsin.
 Từ năm 1971, người ta đã thành công trong việc dung chymotrypsin cố
định trên carboxylmethylcellulose để làm dông tụ sữa thay cho rennin
đắt tiền
[3]
.
14
 Phân loại:
 Rennin là một protease acid tính, số phân loại E.C.3.4.4.3. Rennin đặc
biệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (chủ yếu casein
của sữa).
 Rennin là enzyme thuỷ phân liên kết peptit trong protein có trọng lượng
phân tử khoảng 33.000 – 34.000 Da. Rennin tinh khiết có dạng tinh thể
hình lập phương. Về mặt cấu tạo phân tử, rennin có mạch polypeptit có
gắn glycine trong mạch có vòng cacbon. Các liên kết hydro có thể đóng
vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng
hoạt động. Trong thành phần hoá học, rennin chứa nhiều amino acid có
tính acid nhưng ít hơn pepsin. Do đó, rennin thể hiện tính acid yếu hơn
pepsin.
 Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin:
 Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của
rennin pI = 4,5. Rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không
thấm qua màng tế bào ở môi trường kiềm.
 Đặc hiệu thuỷ phân:
 Rennin chỉ thuỷ phân các liên kết peptit và không làm ảnh hưởng đến
liên kết ester và amin. Rennin đặc biệt có tác động mạnh lên các liên
kết được tạo nên bởi tyrosine và phenylalanine.
 Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác.
Đặc tính thuỷ phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH. Ở pH
= 6,8 rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH = 2,3 thì phân cắt 1/8 số
liên kết peptit trong phân tử casein.
 Sự hoạt hoá prorennin thành rennin:
 Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite được giữ
lại trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme.
 Quá trình hoạt hoá prorennin giống sự hoạt hoá pepsinogen, ở pH < 3
quá trình chuyển hoá từ prorennin thành rennin xảy ra rất mạnh. Nhưng
quá trình hoạt hoá prorennin không phải là quá trình tự xúc tác và peptit
được giải phóng ra không thể có tác động kìm hãm với rennin.
 Các yếu tố ảnh hưởng:
15
 Hoạt động xúc tác tối ưu của rennin ở pH = 3,7; pH tối ưu của rennin
nằm ở vùng pH acid yếu hơn so với pepsin và thay đổi tuỳ theo cơ chất
vào khoảng 3,4 – 4. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid
vừa phải và cần có sự hiện diện Ca
2+
. Ở pH = 3,7, các ion Ca
2+
làm tăng
hoạt độ rennin, những cation hoá trị 1
+
làm giảm hoạt độ của nó.
 Ở pH = 7 có sự tự phân huỷ và hoạt tính thuỷ phân của rennin ở pH này
rất thấp. Hoạt tính bị giảm khi pH > 6 kèm theo sự xuất hiện protein kết
tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao.
 Rennin tiếp xúc trong môi trường kiềm yếu pH = 9 sẽ bị bất hoạt dần
nhưng trong môi trường acid mạnh sẽ bất hoạt nhanh chóng.
 Bảo quản rennin:
 Dịch rennin có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màu
trắng đến nâu nhạt.
 Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15
o
C. Dịch rennin được bảo quản ở
nồng độ cao 14 – 20% và có thể thêm Na – benzoate và propylene –
glycol để bảo quản.
 Thu nhận enzyme rennin:
 Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) dưới
5 tháng tuổi.
 Xử lý sơ bộ: tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn
ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân
trọng lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh , không nên rửa quá kỹ sẽ làm
mất enzyme, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%.
 Xay nhuyễn: Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miếng nhỏ
khoảng 1cm rồi xay nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo
điều kiện cho quá trình trích ly.
 Chiết enzyme và chỉnh pH = 4:
 Bản chất của quá trình chiết tách enzyme từ màng nhầy dạ dày động
vật là sự phối hợp của ba giai đoạn: phá vỡ tế bào, hoạt hoá và chiết
tách enzyme.
 Có hai phương pháp là: phương pháp chiết và phương pháp tự phân. Cả
hai phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: enzyme rennin được giải
16

Xem chi tiết: Công nghệ Protease